martes, 26 de abril de 2016

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR: REPLICACIÓN-2/4


Meselson y Stahl (1958) intentaron averiguar como se copiaba (replicación) el ADN. Llegaron a la conclusión de que el proceso era semiconservativo. Para demostrarlo prepararon unas muestras de ADN con N pesado (15N), que posteriormente fue introducido en un medio con N normal (14N). En el medio con N15 las bacterias lo incorporan en su material genético, de modo que éste será más pesado. Cuando son transferidas a un medio con N14 seré éste el que se incorpore, variando así el peso de la molécula. Tas los cultivos se sometieron a centrifugación, para aislar el ADN, y observar su peso a través de las diferentes bandas que se pudieran formar
Las opciones que propusieron en cuanto a como se copiaba (replicaba) el material genético fueron:
-          hipótesis conservativa- la cadena de ADN sirve de molde para formar una nueva, pero las cadenas viejas y las nuevas quedan por separado formando las dobles hélices, es decir, una doble hélice lleva las 2 cadenas viejas (pesadas, N15) y la otra doble hélice las 2 cadenas nuevas (ligeras N14), lo que mostraría 2 claras bandas de acuerdo a su peso, banda pesada y banda ligera.
-          hipótesis dispersiva- la cadena de ADN sirve de molde, pero las dobles hélices se forman a partir de fragmentos tanto de las cadenas viejas como de las nuevas. Esto originaría una mezcla de ambos pesos, lo que no daría lugar a una banda definida, se formaría una zona ancha correspondiente e intermedia, correspondiente a la mezcla de ambos pesos N15-N14.
-          hipótesis semiconservativa- la cadena de ADN sirve de molde, pero las dobles hélices se forman con una cadena vieja y otra nueva, así ambas dobles hélices llevan tanto una cadena molde como otra de nueva síntesis. Tras dos divisiones celulares se observará una banda de peso intermedio (hebra pesada N15 + hebra ligera N14) y otra banda de peso ligero (hebra ligera N14 + hebra ligera N14).


El experimento demostró que las nuevas dobles hélices portaban una cadena con N15 y la otra con N14, es decir, una hebra antigua y otra nueva, de modo que se confirmaba la hipótesis semiconservativa.

vídeo:   experimento Meselson & Stahl- replicación semiconservativa
                 replicación semiconservativa





vídeo: Replicación bidireccional ADN-circular-procariota


REPLICACIÓN

La replicación es el mecanismo que permite la copia exacta de la información contenida en el ADN. Este proceso tiene lugar para mantener la información que será transferida a las células hijas (tanto en células procariotas como eucariotas). Ocurre en ambos grupos celulares, aunque con ciertas diferencias.


CÉLULA PROCARIOTA-BACTERIAS


Las células procariotas tienen un cromosoma circular único de ADN. La copia  del material genético empieza en un único punto, Ori C, que genera una burbuja de replicación (separación, apertura de la doble cadena de ADN), replicón. En procariotas solo existe una burbuja de replicación, mientras que en eucariotas hay multiples, al ser cromosomas más largos.

El ADN está formado por dos cadenas antiparalelas (5’-3’/3’-5’), ambas cadenas son copiadas y la copia es bidireccional (se copia en ambas direcciones). En uno de los lados se copia al tiempo que se va abriendo la burbuja de replicación (la doble hélice). El punto que se va abriendo para ir replicando recibe el nombre de horquilla de replicación. Para permitir estos procesos (apertura de la doble hélice y copia) intervienen diversas enzimas y proteínas:
-para separar ambas hebras interviene la enzima helicasa, a medida que se abre la horquilla aumenta la compactación de la hebra, para evitarlo actúan las topoisomerasas I, II (= girasa). Además para mantener la hebra abierta actúan las proteínas estabilizadoras de la hebra las SSB.

A continuación actúa la ADN-polimerasa III que añade los nucleótidos complementarios de la cadena que se está copiando, pero estos nucleótidos solo pueden añadirse en sentido 5’-3’, de modo que tiene que copiar la cadena de sentido opuesto, la que presenta sentido 3’-5. Solo una de las cadenas presenta el sentido que se necesita a la vez que se va abriendo, a esta cadena se la llama hebra conductora. Mientras que la otra hebra presenta sentido antiparalelo, se va a llamar hebra retardada. Esta hebra se va a copiar por fragmentos (fragmentos de Okazaki).
Por otra parte, la ADN-polimerasa III no puede actuar sin tener un apoyo previo, para poder actuar necesita que ya exista un pequeño fragmento de nucleótidos. Este fragmento lo coloca una ARN polimerasa, sitúa un pequeño fragmento llamado  primer o cebador.
A medida que la horquilla de replicación se va abriendo, las dos hebras (una en sentido 5’-3’ y la otra 3’-5’) se van copiando, pero la 3’-5’ será la hebra conductora, ya que permite la adición de nucleótidos en sentido 5’-3’, a la vez que la propia doble hélice se va abriendo. Esta cadena se copia de forma continua y más rápida. La hebra complementaria, la 5’-3’ (la hebra retardada), muestra un sentido antiparalelo a la adición de nucleótidos, (adición siempre en sentido 5’-3), de modo que ha de copiarse en sentido opuesto al de apertura de la doble hélice, lo que da lugar a pequeños fragmentos, los fragmentos de Okazaki, que forman la hebra retardada.

Para copiar cualquiera de las dos hebras se necesita la ADNpolimerasa III, pero como ya se ha dicho, requiere que primero actúe una ARN polimerasa primer, que ponga una secuencia de nucleotidos (de ARN) sobre los que se apoye la ADNpolimrasa III. Una vez que se ha copiado la secuencia de la cadena de ADN  interviene una ADNpolimerasa I, que sustituye los fragmentos de ARN del cebador por nucleotidos de ADN. Además, en el caso de la hebra retardada es necesario la unión de los distintos fragmentos de Okazaki, para ello ha de actuar una ligasa.
A medida que se va realizando todo el proceso de copia y sustitución de los cebadores, las ADNpolimerasa I, II presentan una actividad correctora de errores, con capacidad endonucleasa (reconocimiento del error y corte de la secuencia) y exonucleasa (eliminación de la zona erronea) y es sustituida por los nucleótidos correctos por la ADNpolimerasa III.
 Para reconocer la cadena de nueva síntesis y la original ésta aparece metilada, proceso que se realiza tras la corrección de errores.



  vídeos:   Horquilla de replicación

              Replicación

              Replicación




En el caso de Eucariotas

Los procesos de replicación del ADN en las células eucariotas son semejantes, solo hay pequeñas diferencias:
-          presentan un número mayor de replicones.
-          Existe un número mayor de ADN polimerasas (cinco, α, β, γ, δ, ε)
-    También es necesario copiar las histonas, las histonas antiguas se quedan en la hebra conductora, mientras que las nuevas histonas se incorporan a la hebra retardada.

-         Al tratarse de un cromosoma lineal (el procariota era circular con lo que no existen extremos), los extremos no pueden ser copiados, ya que al sustituirse el cebador por ADN la ADN polimerasa debería “apoyarse por fuera de la cadena”, de modo que la cadena se va acortando. Estos extremos constituyen los telómeros del cromosoma, que presentan secuencias repetidas para precisamente evitar la pérdida de información tras las sucesivas divisiones. No obstante, tras un número determinado de divisiones, y por consiguiente la pérdida de determinado número de copias de los telómeros, la célula entra en apoptosis.


Vídeo: Adición nucleótotidos durante la replicación





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