Clonación génica
Procariotas
Se aísla el gen de interés, se corta por la acción de enzimas de
restricción. Se elige un vector de clonación, un plásmido, que se corta con las
mismas enzimas de restricción para que genere los mismos tipos de extremos. Se
inserta el gen de interés y con la ligasa se unen los extremos. Junto con el
gen de interés se inserta un gen marcador, por ejemplo un gen de resistencia a
antibióticos. El vector (plásmido) se
introduce en la bacteria, se somete la bacteria a antibiótico, las que sobreviven
llevan insertado el plásmido con el gen. También se pueden utilizar
bacteriofagos (fago λ, M13) para introducir el plásmido en la bacteria. Las bacterias
elegidas no deben ser patógenas, tienen que presentar un crecimiento rápido y
capacidad para captar los plásmidos (bien por transformación o por transducción)
vídeo: enzimas de restricción
clonación génica
Eucariotas
Se pretende modificar el organismo por completo (organismo modificado
geneticamente OMG) o realizar una terapia génica (modifica solo la secuencia de
determinadas células, las dañadas).
Es un proceso más complejo como consecuencia de tener más cromosomas, de
presentar intrones y exones, cuesta más insertar el gen ya que tiene que
atravesar la envuelta nuclear. Además en general los organismos eucariotas son
pluricelulares y cada célula exprese una determinada información aunque todas
las células posean toda la información. Las técnicas a emplear no son las
mismas si lo que se quiere es que todo el organismo esté modificado o solo se quiere
modificar determinadas células (tejido). Si es todo el organismo el que se
quiere modificar la técnica hay que aplicarla a nivel de gametos o cigoto.
Por otra parte para introducir los genes hay que utilizar otras técnicas,
ya que las células eucariotas no presentan procedimientos naturales para captar
ADN.
El proceso se inicia de forma similar al de procariotas, seleccionando el
gen de interés y aislándolo. También se puede hacer una secuencia artificial, siempre
que se conozca su secuencia (ADNc; ADNnovo). Una vez que se tiene la secuencia se
inserta en el vector (bacteria, virus, cromosoma de levadura) que se
incorporara en el cromosoma eucariota. Para ello se puede preparar un plásmido
(para vegetales), se inserta en la bacteria Agrobacterium
tumefaciens, que presenta el plasmado Ti en el que se inserta el gen de
interés. Con esta bacteria se genera una infección en la planta, que así
transfiere el gen a las células eucariotas. Esto se realiza en una etapa
temprana de germinación de la planta con lo que se consigue que toda la planta
termine presentando el gen de interés, se obtiene así una planta transgénica.
En tejidos animales, en lugar de bacterias se utilizan virus, se introduce
el material genético en el virus e igualmente se provoca una infección en el
organismo o tejido deseado, se genera así una infección vírica y por tanto una
transferencia del material genético a la célula hospedadora (se suelen usar
retrovirus, adenovirus y virus de la viruela)
Otra opción es crear cromosomas artificiales en levaduras (YAC, Saccharomyces cerevisiae, hongos) se modifica el gen de la levadura, se inserta
la secuencia deseada y se inserta en la levadura.
Vídeo: Inserción genes mediante plásmido Ti
Para lograr
introducir el gen en la célula eucariota existen diversas técnicas (además de
generar infecciones con bacterias o virus):
- Pistola de genes, que dispara el gen de inters y por tanto éste atraviesa
la membrana hasta llegar al núcleo. El
problema es que no se puede saber donsde se inserta el gen.
- Electroporación, se somete la célula a descargas eléctricas que generan
pequeñas poros que permiten que entre el gen de interés, pero tampoco se sabe
si se inserta correctamente
-Microinyección, se inyecta en el núcleo de la célula el gen de interés de
modo directo.
Nuevas técnicas de inserción de material genético, la Técnica de Edición de Genes o CRISPR-CAS
Vídeo: CRISPR-CAS
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